O2、pH 值和 CO2使用 PreSens SensorPlugs 傳感系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大腸桿菌培養(yǎng)物。

我們測(cè)試了 PreSens SensorPlugs在微流體生物反應(yīng)器 （MB） 中監(jiān)測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)物的功效，這在監(jiān)測(cè)培養(yǎng)肉生物工藝中的潛在污染時(shí)非常重要。 大腸桿菌 （ATCC® 25922™） 在帶有集成 SensorPlugs 的定制 MB 中培養(yǎng)。光學(xué)測(cè)量顯示了大腸桿菌生長(zhǎng)的特征過程，并允許隨時(shí)精確評(píng)估當(dāng)前的培養(yǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞培養(yǎng)基是培養(yǎng)肉生產(chǎn)中最重要的成本驅(qū)動(dòng)因素。通過傳感器的額外監(jiān)測(cè)功能優(yōu)化生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和儀器，有助于降低這些成本并實(shí)現(xiàn)每單位培養(yǎng)基體積的最大細(xì)胞生產(chǎn)能力。

長(zhǎng)期以來，生物工藝中一直采用按比例縮小的方法來解決放大問題。小型化生物反應(yīng)器作為一種在早期工藝開發(fā)中獲取工藝相關(guān)數(shù)據(jù)的工具而蓬勃發(fā)展。我們?cè)陂_發(fā)新一代低成本傳感器時(shí)應(yīng)用了這一原理，即“芯片實(shí)驗(yàn)室"（LoC） 方法，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的各種細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，例如生物量、氨。

我們使用定制的微流體生物反應(yīng)器，并輔以我們的阻抗傳感器和光學(xué)傳感器，并結(jié)合 O 傳感器插頭2， CO2和 pH 值，由 PreSens 提供。我們項(xiàng)目的主要思想是嘗試確定微流控生物反應(yīng)器內(nèi)部正在進(jìn)行的過程，并能夠量化對(duì)細(xì)胞行為、細(xì)胞活力和試劑有效性的影響。我們測(cè)試了 PreSens SensorPlugs 在微流控生物反應(yīng)器中監(jiān)測(cè)細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的功效。此外，我們還用人類唾液進(jìn)行了一組試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，作為傳感器在培育肉生物工藝最終產(chǎn)品的味道/風(fēng)味評(píng)估中的應(yīng)用的潛在進(jìn)一步擴(kuò)展。這里顯示了我們的細(xì)菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果。

材料和方法

多層 MB 芯片是使用透明和生物相容性材料玻璃和 PMMA 制造的。頂層和中間層是用 PMMA 制造的，互連層是使用 3M 雙面膠帶（3M™ GPT-020F，圣保羅，明尼蘇達(dá)州 55144-1000，明尼阿波利斯，美國）制成的。用于細(xì)胞培養(yǎng)的芯片的底層由玻璃制成，其中阻抗傳感器是用商用 Agfa-Gevaert NV 納米銀墨水和 15% 的 Ag 納米顆粒和導(dǎo)電墨水打印的，使用壓電控制噴墨打印機(jī) Fuji Dimatix DMP-3000。傳感器上覆蓋有一層薄薄的 SU-8 3000 Microchem 光刻膠。頂層包含入口/出口孔，其直徑適用于在填充芯片時(shí)移液樣品。此外，在頂層還開了三個(gè)直徑為 2.1 mm 的孔，用于安裝 PreSens SensorPlugs。傳感器通過孔與樣品直接接觸，從而能夠?qū)崟r(shí)測(cè)量樣品中的參數(shù)。在芯片中間層制成的儲(chǔ)液槽的樣品體積為 1.8 mm。通過在胰蛋白胨大豆肉湯中接種細(xì)菌來制備大腸桿菌的過夜培養(yǎng)物。之后，使用過夜培養(yǎng)物制備 0.5 McFarlan 大腸桿菌培養(yǎng)物 （1.5 x 10 CFU/mL），用于在 MB 中培養(yǎng)。我們將芯片與 PreSens 傳感器一起留在 37 °C 的微生物培養(yǎng)箱內(nèi)（圖 1）。

監(jiān)控 O₂， CO₂和培養(yǎng)過程中的 pH 值

O 的測(cè)量結(jié)果₂， CO₂和微流控芯片中大腸桿菌培養(yǎng)過程中的 pH 值如圖 2 所示。pH 值測(cè)量（圖 2a）在培養(yǎng)大腸桿菌 3 小時(shí)期間給出了預(yù)期的結(jié)果。在初始滯后階段之后，細(xì)菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，其特征是細(xì)胞倍增率，即生成時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)室中，大腸桿菌的生成時(shí)間從大約 15 - 20 分鐘到 40 分鐘不等。因此，在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定大腸桿菌的濃度。圖 3 顯示了血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的放大部分，即計(jì)數(shù)細(xì)胞單位的正方形。用微量移液管稱取 10 μL 并置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。當(dāng)計(jì)算所有方塊中的細(xì)胞單位總數(shù)時(shí)，計(jì)算平均值并確定芯片上的總濃度。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)過程。細(xì)菌數(shù)量增加了近 13 倍。圖 2 顯示，t = 0 分鐘時(shí)的初始 pH 值（當(dāng)我們?cè)谖⒘黧w芯片內(nèi)接種細(xì)菌培養(yǎng)物時(shí)）約為 7.3。三小時(shí)后，我們觀察到細(xì)菌培養(yǎng)物酸化 （pH ~ 6.8） 和 CO 百分比增加₂，同時(shí) % O 降低₂在孵化期間。這些圖表顯示了大腸桿菌生長(zhǎng)的預(yù)期特征過程。在第一個(gè)滯后生長(zhǎng)期 （~ 1.5 h），pH 和 CO 沒有顯著變化₂.在這個(gè)階段，消耗了氧氣。~ 1.5 小時(shí)后，CO₂水平呈指數(shù)級(jí)上升，O₂減少。在這個(gè)階段，TBS 培養(yǎng)基被細(xì)菌消耗，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。氧含量隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而降低，并在實(shí)驗(yàn)期間降至零水平。這也表現(xiàn)在 CO 的增加₂.由于氧氣有限，大腸桿菌細(xì)胞無法再在微流控芯片內(nèi)生長(zhǎng)，該過程進(jìn)入固定相。3 小時(shí)后，O₂水平下降到 3%，而 CO₂增加到 4 %。用于微生物培養(yǎng)監(jiān)測(cè)的傳感器顯示出全面的結(jié)果，并允許精確評(píng)估當(dāng)前的培養(yǎng)狀態(tài)。

結(jié)論

根據(jù)所呈現(xiàn)的結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，PMMA 制造的是一種監(jiān)測(cè)基本參數(shù) （O2、pH 值、CO2） 在微流控細(xì)菌培養(yǎng)物中。PMMA 制造的 對(duì)于培養(yǎng)生物過程優(yōu)化中的按規(guī)模縮小方法分析和過程監(jiān)控非常重要。未來的實(shí)驗(yàn)將針對(duì)培養(yǎng)過程的持續(xù)監(jiān)測(cè)和優(yōu)化，檢查精油和抗生素對(duì)微生物反應(yīng)器內(nèi)不同抗菌和抗真菌活性的影響。該研究將側(cè)重于尋找 pH 值、O 讀數(shù)之間的相關(guān)性2和 CO2帶有附加傳感器（阻抗、光學(xué)和電化學(xué)）的傳感器集成到我們?cè)谘芯克_發(fā)的微流體生物反應(yīng)器中，用于測(cè)量介質(zhì)、代謝物或生物質(zhì)的電導(dǎo)率。